Kannel等[1]于1979年在美国医学协会杂志(JAMA)发表了著名的Framingham心脏研究，首次明确指出糖尿病能够增加心血管疾病(CVD)2～3倍，之后的大量临床研究均证实糖尿病能够显著增加心血管疾病的风险及病死率，并把糖尿病作为冠心病的等危症(Equivalent)[2]。Sowers等[3]的研究显示，与非糖尿病患者相比，肥胖型糖尿病患者的CVD发病率和死亡率更高，约有70%的糖尿病患者死于心血管疾病，包括冠心病、高血压、心衰和脑卒中。
UKPDS研究数据显示，良好地控制血糖能够有效地防止或减少糖尿病微血管病变，但不能使糖尿病大血管病事件率下降[4]，提示高糖不是决定糖尿病大血管并发症发生的主导因素。另外，圣安东尼奥心脏研究对没有糖尿病或糖耐量受损的男性进行研究，发现胰岛素抵抗增加了2.5倍心血管疾病风险，即使在校正了11项心血管危险因素如低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油、吸烟等后，胰岛素抵抗仍增加了2倍心血管疾病的危险[5]。因此，高胰岛素血症、胰岛素抵抗被认为是CVD事件发生的独立危险因素[6,7]。
动脉粥样硬化(AS)是CVD发病最重要的病理生理基础，而内皮功能紊乱则被认为是AS解剖学证据出现之前的早期表现，也是AS产生的始动因素。尽管血管内皮细胞不是胰岛素经典的靶器官，但胰岛素信号通路对于维持正常的内皮功能发挥至关重要的作用[8]。胰岛素能够直接刺激血管内皮释放一氧化氮(NO)，还可通过激活和诱导内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，从而增加NO生成，引起内皮依赖性舒张功能[9,10]。胰岛素通过激活Akt，抑制caspase-9活性，从而抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，胰岛素的这一抗凋亡效应和血管内皮细胞生长因子(VEGF)相当，已知VEGF是血管内皮细胞强有力的抗凋亡因子[11]。氧化应激产物(ROS)能够抑制eNOS和前列环素(PGI2)合成酶的活性，导致内皮功能紊乱，而胰岛素能够减少内皮细胞ROS的生成，增加eNOS和PGI2合成酶的活性[12]。此外，有研究显示胰岛素能够抑制血管内皮细胞VCAM-1的表达，抑制炎症细胞在内皮细胞上的粘附和聚集[13]。对血管内皮胰岛素受体基因敲除的apoE基因缺失小鼠进行的研究发现，胰岛素受体缺失的小鼠其动脉粥样硬化病变范围是对照组的2～3倍，而缺失小鼠的糖耐量、血浆胰岛素、血清胆固醇以及血压均和对照小鼠无显著差异，提示内皮胰岛素信号通路的缺失或抵抗，而非其他系统性的危险因素，会加速动脉粥样硬化的形成[13]。综上所述，胰岛素信号通路对维持血管内皮功能起着关键作用，正常的血管内皮可抑制血小板聚集、白细胞粘附、血栓形成和血管平滑肌收缩。而胰岛素抵抗(IR)能够导致内皮细胞源性的NO生成减少，舒张功能障碍；使内皮素-1(endothetin-1)等缩血管物质增加，血管收缩性增加；导致VCAM-1的表达增加，白细胞粘附和聚集，最终导致内皮功能紊乱[14]。
缺血组织通过新生血管提高灌注这一能力的受损，即缺血组织血管新生能力的下降，是糖尿病血管病变发生的病理基础之一。缺氧诱导因子(HIF)活性减弱、生长因子信号通路的改变、缺血时炎症反应的异常、骨髓源性促血管形成细胞的动员和功能的改变均会引起糖尿病患者上述能力的损伤[15]。内皮胰岛素信号通路对于维持组织的正常灌注以及缺血组织的血运重建也具有重要的作用。胰岛素通过增加内皮细胞NO的产生，引起血管舒张，从而导致血流量的增加。另一方面，胰岛素还能够诱导毛细血管募集(capillary recruitment)，增加组织的血液灌注量[8]。对高胰岛素正血糖钳夹试验的大鼠研究发现，在不改变血糖的情况下，血浆胰岛素水平增加2倍，大鼠后腿的血液灌注量也增加了2倍，此现象出现在胰岛素输注后的5 min，而此时毛细血管的血流量并未增加，提示毛细血管募集的增加是导致血液灌注量增加的主要因素[16]。研究显示胰岛素诱导的毛细血管募集和组织灌注量可以被NO合成酶抑制剂阻断，其在肥胖的大鼠以及肥胖人群和2型糖尿病患者中明显下降[16,17]。随着动脉粥样硬化的形成，冠状动脉逐渐发生堵塞、缺血和缺氧，在机体对心肌缺血、缺氧的应答过程中，包括NO和VEGF在内的血管生长因子被组织动员和激活，新生血管形成从而代偿血流量的减少[15]。实验发现，胰岛素能直接作用于血管内皮细胞促进血管新生[18]。内皮细胞胰岛素受体基因特异剔除的小鼠在缺氧的环境中，其视网膜新生血管形成会明显减少，视网膜周细胞的数量下降57%，这种视网膜新生血管的减少在数量上与抗VEGF治疗效果相当[19,20]。皮肤创口愈合延迟也是困扰糖尿病患者的一大问题，新生血管的形成在创口愈合过程中发挥至关重要的作用，研究显示在内皮细胞的胰岛素受体和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)受体双基因剔除的小鼠，皮肤创伤组织新生血管形成显著减少，创口延迟愈合[21]；而在一个内皮胰岛素受体底物1(IRS1)转基因的小鼠模型中，内皮胰岛素信号通路的增强能够显著促进新生血管的形成和皮肤创口愈合[22]，提示内皮胰岛素信号通路在糖尿病患者组织缺血后以及组织创伤后新生血管形成和血运重建过程中发挥重要的作用。
胰岛素可以通过PI3K-Akt和Ras-MAPK信号通路调控内皮细胞的多种生物学功能，Ras-MAPK通路的激活导致内皮素的产生增加，引起血管的收缩[8]。PI3K-Akt是胰岛素在内皮细胞中发挥功能的主要通路，调控了包括FoxO、eNOS、VEGF、VCAM-1、BAD、caspase 9等诸多下游因子的活性[10,11,13]，这其中由FoxO1、3、4基因编码的FoxO家族转录因子，作为内皮细胞中Akt的主要作用底物参与了内皮生长、血管新生、内皮-白细胞的相互作用等过程的调控[8,23]。
在内皮细胞中，FoxO1和FoxO3a抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的转录，促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，引起内皮功能的紊乱[24]。通过构建FoxO1、3、4基因敲除小鼠，Tsuchiya等[25]发现，敲除内皮细胞的FoxOs基因能够增加内皮NO的产生，促进细胞的生长，抑制内皮炎症和过氧化物的产生，最终防止小鼠出现动脉粥样硬化，这提示了FoxO基因从多方面造成了内皮细胞功能的紊乱，从而促进了AS的形成。Paik等[26]发现，内皮细胞FoxO转录因子在后天的血管动态平衡和血管新生中有抑制血管生成的作用。在成年小鼠敲除FoxO1、3、4基因导致在子宫、肝脏和骨骼肌等多器官发生血管瘤，这与敲除小鼠的内皮细胞增殖增加以及凋亡减少有关，提示FoxOs基因可抑制新生血管生成[26]。
在内皮细胞中，胰岛素促进血管新生的分子机制还不甚清楚。已知胰岛素通过Akt磷酸化FoxO，导致FoxO从核内转移至胞浆，抑制对其下游靶基因的转录调控[27]。Paik等[26]在研究FoxOs基因对内皮细胞稳态调节的过程中，发现了21个受FoxO转录调控的靶基因，本文作者王宣春等[28]检验了这些FoxO调控的靶基因，以明确在内皮细胞中胰岛素是否能够调控这些基因的表达以及调控是否通过FoxO1依赖的模式。该研究在内皮细胞中发现了10个受胰岛素调控的FoxO靶基因，这些基因可能参与了胰岛素调控的内皮血管新生过程。接下来，一个HIF-1α转录抑制因子-CITED2(CBP/p300-interacting transactivator with ED-rich tail 2)被重点进行了研究[29]。该研究具体描述了在内皮细胞中，胰岛素如何调控CITED2的表达，在胰岛素抵抗、2型糖尿病小鼠和2型糖尿病患者中CITED2的表达是如何失调的，以及CITED2在内皮血管新生中发挥的作用和分子机制。由于发现CITED2可抑制内皮细胞中HIF的转录激活，因此该研究指出如果抑制CITED2的表达，可能会改善2型糖尿病患者血管新生能力受损的问题，这对将来探索糖尿病患者血管并发症的治疗有深远意义。本文将对该研究进行详细的描述。
在Paik等[26]的研究中，不同亚型FoxO基因被单独敲除，发现FoxO1基因敲除的促血管形成最显著，而FoxO3、FoxO4基因敲除小鼠相对而言不容易引起血管瘤形成，提示FoxO1对内皮细胞稳态的调控作用最强。鉴于以上发现，我们采用LoxP-Cre系统将小鼠原代血管内皮细胞中的FoxO1完全剔除，同时不影响FoxO3和FoxO4的表达。结果显示，FoxO1基因缺失显著改变了Adm、Cited2、Ctgf、Fbn1、Hmga2、Klf6、Spry2、Tcf4、Pbx1、Noct基因的表达，Ccnd1、Meis1、Mrc1、Sdpr、Selm、Tsc22d1不受FoxO1基因剔除的影响，而Bmper、Id1、Pcolce、Rab34基因的表达与Paik等[26]的研究结果相反，Nrep由于表达量很低则未检测到。
由于FoxO1基因缺失会引起内皮细胞中胰岛素受体底物IRS1和IRS2表达的显著减少[25,28]，因此FoxO1基因剔除的细胞模型并不适合于胰岛素调控的研究，我们决定采用过表达FoxO1的内皮细胞研究胰岛素对上述基因的调控作用，为此在小鼠的血管内皮细胞株MS1中分别用腺病毒过表达了野生型的FoxO1基因(wt)和构成性激活的FoxO1突变基因(T24A/S253D/S316A, FoxO1 CA)，同时以表达GFP的腺病毒为对照组。首先将MS1内皮细胞在血清中饥饿培养1夜，然后再用10 nmol/L的胰岛素分别处理内皮细胞2、4、8和16 h，对照组则不接受胰岛素刺激，然后检测各时间段各组内皮细胞中上述10个显著受FoxO1调控基因的表达情况。结果发现，在经典的FoxO1依赖模式下，胰岛素使Adm、CITED2、Ctgf的表达下调，过表达野生型的FoxO1导致上述基因上调，而在构成性突变FoxO1(FoxO1 CA)过表达组胰岛素的作用消失；Klf6、Spry2、Tcf4的表达受胰岛素作用而下调，胰岛素能使Pbx1表达上调，但上述基因不受FoxO1过度表达的影响，提示胰岛素对这4个基因的调控作用并不依赖FoxO1；胰岛素和FoxO1均能使Noct的表达上调；胰岛素对Fbn1和Hmga2的表达调控与FoxO1相反，这符合经典的调控模式，但这种改变与FoxO1基因敲除的内皮细胞模型中的结果并不一致。通过对Paik等[26]筛选出的21个FoxO靶基因在FoxO1基因缺失和过表达内皮细胞中进行层层筛选，我们最终确定了3个FoxO1介导的受胰岛素调控的基因，其中Ctgf基因表达在胰岛素作用2 h后下调了80%，CITED2下调了60%，Adm2在胰岛素作用16 h后下调了54%。
Ctgf编码结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)，Adm2编码肾上腺髓质素(adrenomedullin)，相比较其他组织，Ctgf和Adm在血管内皮细胞中的表达并不高，并且已有研究报导这二者参与了新生血管的调控过程[30,31]，这使得以这二者为靶点研究胰岛素在内皮血管新生过程中作用的研究的重要性大大下降。CITED2编码一种转录共调节因子，已有研究显示在非内皮细胞中CITED2能够抑制HIF1α的转录活性[29]，而HIF已被证实在内皮细胞生物学功能，包括血管新生过程中发挥至关重要的作用，为此，我们提出科学假想：胰岛素通过调控CITED2的表达，影响HIF1α的转录活性，从而在内皮血管新生过程中发挥重要作用。
我们首先对胰岛素是如何调控CITED2基因和蛋白的表达进行了详细的探索，不同浓度的胰岛素在体外干预MS1内皮细胞后，10 nmol/L的浓度已经能够将CITED2的基因表达显著抑制到50%以下，这一效应和100 nmol/L相似，由于高浓度(100 nmol/L)的胰岛素除了胰岛素受体，还能够激活IGF-Ⅰ受体，使得问题复杂化，在后续研究中均选用10 nmol/L的胰岛素。对于不同的作用时间，研究显示胰岛素作用2 h，CITED2 mRNA减少最多，而蛋白在作用8 h后下降最明显，胰岛素的这种抑制效果在CITED2基因和蛋白水平均在50%以上。当用胰岛素受体拮抗剂S961、PI3K抑制剂LY294002或者Akt抑制剂MK2206预处理内皮细胞，胰岛素对CITED2的调控作用基本消失，说明胰岛素对CITED2的调控是通过胰岛素受体-PI3K-Akt信号通路实现的。
为了明确CITED2与糖尿病血管病变的关联性，我们首先检测了CITED2在胰岛素抵抗实验动物模型血管内皮细胞中的表达，发现高脂饮食诱导的肥胖糖尿病小鼠血管内皮细胞(从小鼠心肌组织中原代分离)的CITED2 mRNA是低脂饮食小鼠的1.6倍，在另一个糖尿病小鼠模型-db/db小鼠中，CITED2基因在内皮细胞中的表达也比db/＋小鼠上升了1.9倍，上述差异均有显著性。接下来，我们又测定了肥胖伴2型糖尿病患者(4人)和与之年龄相匹配的非糖尿病患者(5人)乳动脉组织中CITED2的表达，结果发现，肥胖伴糖尿病患者血管组织中CITED2的表达是对照组的3.8倍(T检验显示P＝0.003；秩和检验P＝0.04)；免疫组化显示，CITED2在人血管组织中主要表达于内皮细胞，说明内皮CITED2的表达增加是肥胖伴糖尿病患者血管组织中CITED2表达上调的主要因素。虽然本实验样本数量有限，但是这些数据提示在肥胖伴糖尿病患者的血管内皮中，CITED2的表达上调和早前证实的2型糖尿病患者存在内皮胰岛素抵抗的现象一致[32,33]。值得关注的是，在我们中糖尿病患者的糖化血红蛋白、血压、血脂已经被控制在理想水平，但CITED2的这种表达差异仍然存在，提示了使用CITED2抑制剂治疗糖尿病血管病变具有潜在的意义。
CITED2在糖尿病血管内皮细胞中的表达失调提示其在血管病变的发生过程中发挥重要作用，为此我们接着探讨了CITED2对内皮细胞生物学功能的调节作用。我们用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)来进行这个实验，这是因为人的内皮细胞较小鼠内皮细胞更适合来做管形成(tube formation)实验[34]。与在MS1内皮细胞和小鼠心肌内皮细胞中的结果一样，胰岛素也能够显著减少HUVEC中CITED2的表达。RNA干扰技术抑制CITED2的表达后，HUVEC在基质胶(Matrigel)的管形成能力明显增强，细胞的增殖也显著增加了(2.1±0.3)倍，由于管形成能力和细胞增殖是衡量内皮细胞血管新生的重要指标，这部分结果说明CITED2对血管新生具有负调控作用，也提示抑制CITED2能够促进糖尿病缺血组织或创口的血管新生。
CITED2已经被证实能在多种细胞中调节HIF的转录激活[29]，但是并没有阐述CITED2在任何包括内皮细胞在内的血管细胞中的效应。由于分子结构中缺少DNA结合域，CITED2不能直接结合到靶基因的启动子从而调控下游基因的转录，但其能够和其他转录因子结合，抑制或激活某些转录因子的活性。HIF1α需要和CBP/p300形成复合体发挥转录调控功能，CITED2通过和HIF1α竞争性地结合CBP/p300而抑制HIF1α的转录活性[29]。为了明确血管内皮细胞中CITED2对HIF1α转录调控作用的影响，我们使用了能够受HIF1α转录调控的含缺氧调节元素(HRE)启动子的荧光素酶报告基因，结果显示过表达CITED2后，HUVEC荧光素酶的活性减少了59%±4%，说明CITED2能够抑制内皮细胞中HIF1α的转录激活，从而抑制HIF1α介导的内皮细胞的血管新生能力。
为了说明CITED2可在体内调节内皮细胞的HIF活性，我们建立了CITED2血管内皮细胞特异剔除的小鼠模型，采用后腿缺血实验(hind limb ischemia)研究了内皮素-1基因在缺血缺氧的野生内皮细胞和CITED2基因剔除内皮细胞中的表达，已知内皮素-1是HIF转录调控的靶基因，并能够促进内皮细胞的血管新生[35,36]。实验发现内皮细胞中的内皮素-1基因的表达是非内皮细胞中的(24.2±3.2)倍，因此通过检测内皮素-1基因的表达可以间接评判内皮细胞中HIF的转录活性。在对照小鼠，缺血组织中内皮素-1基因的表达是非缺血组织的(2.7±0.4)倍，而在内皮细胞CITED2基因剔除的小鼠，缺血组织内皮素-1基因的表达较非缺血组织增加了(4.1±0.4)倍(同对照小鼠比较，P＝0.02)。本实验结果提示CITED2可以在缺氧状态下抑制内皮细胞HIF的转录激活，并且支持了CITED2的表达增加可能加剧2型糖尿病患者的HIF功能紊乱，导致缺血组织的血管新生功能下降。
糖尿病大血管病变已经成为糖尿病致死的主要原因，而内皮细胞功能紊乱被认为是糖尿病患者大血管病变的始动和关键因素，糖尿病的特点之一是缺血组织通过新生血管提高灌注这一能力的受损[15]。胰岛素信号通路的异常不但会加速AS形成，也会影响内皮新生血管的形成。Paik等[26]发现FoxOs基因可抑制新生血管生成，且进一步研究发现了一批受FoxOs转录调控的靶基因。王宣春等[28]对这些FoxOs靶基因进行检验和探究，发现在内皮细胞中，胰岛素可通过胰岛素受体-PI3K-Akt-FoxO1信号通路显著下调CITED2的表达，而在胰岛素抵抗背景下，CITED2在小鼠和人的血管内皮细胞中显著上调。功能研究发现，CITED2通过抑制HIF的转录活性，从而抑制内皮细胞新生血管形成。通过对本课题组工作的综合分析，本文作者提出了内皮细胞中调控血管新生的一个新的信号通路：胰岛素-胰岛素受体-PI3K-Akt-FoxO1-CITED2通路(图1)。已有研究发现胰岛素在体内能够显著下调骨骼肌组织的CITED2[37,38]，而胰岛素对CITED2的这种调控作用在2型糖尿病患者显著弱于健康对照人群[37]，CITED2通过增加PGC-1α的转录共激活活性而促进肝糖异生[39]。因此，抑制CITED2对于糖尿病患者有可能既能促进血管新生，又能改善胰岛素的敏感性，提出CITED2有望成为治疗糖尿病及其大血管病变的一个新的药物靶点。但是正如Sowers等在评价这篇文章的述评中指出的，如果要证实CITED2是否可以作为糖尿病血管病变的药物治疗靶点，有些因素还需要全面的考虑[40]。第一，CITED2是正常心脏发育过程中一种重要的转录因子。研究发现Cited2基因缺失小鼠存在着心脏畸形、肾上腺发育缺如和露脑畸形，导致小鼠胚胎死亡[41]。第二，以CITED2为靶点促进新生血管形成在某些情形下可能并不是一件好事。例如，过量的新生血管形成可以参与各种疾病，如肿瘤、糖尿病视网膜病变等。提高HIF1信号通路也促进了局部炎症和动脉粥样硬化。但笔者认为，由于2型糖尿病和胰岛素抵抗普遍存在CITED2表达的异常升高，若能纠正这种表达的失调，CITED2仍不失为一个糖尿病治疗的新型药物靶点。
已知心血管病变是糖尿病致死的主要病因，内皮细胞功能紊乱被认为是糖尿病血管病变的始动和关键因素。胰岛素抵抗能够造成血管内皮功能紊乱，加速糖尿病血管病变的进展。胰岛素通过PI3K/Akt信号通路能够抑制FoxOs的功能，而内皮细胞FoxOs，特别是FoxO1，在动脉粥样硬化和血管新生过程中发挥重要功能。我们既往的工作发现了10个在血管内皮细胞中受胰岛素调控的FoxO1靶基因，重点研究了一个转录共调节因子-CITED2在胰岛素调控的血管新生过程中的作用和分子机制。在胰岛素抵抗的背景下，CITED2在饮食诱导的肥胖小鼠、ob/ob小鼠以及伴有肥胖的2型糖尿病患者血管内皮细胞中表达显著升高，而在内皮细胞中，胰岛素可通过胰岛素受体-PI3K-Akt-FoxO1信号通路显著下调CITED2的表达。抑制CITED2能够显著增加内皮细胞的增殖和血管形成能力，而过表达CITED2则能够抑制HIF的转录激活，后腿缺血动物模型研究发现，内皮细胞CITED2基因缺失导致缺血缺氧诱导的HIF靶基因内皮素-1的表达显著升高，提示CITED2通过抑制HIF的转录活性，抑制内皮细胞新生血管形成。综上所述，伴随肥胖和2型糖尿病的胰岛素抵抗引起CITED2的表达增加，导致内皮细胞HIF信号通路和血管新生能力受损，通过抑制内皮CITED2有望找到治疗糖尿病患者缺血性心血管疾病新的治疗方法。