足细胞凋亡是糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)足细胞数量减少的主要原因[1]。既往研究发现，巨噬细胞浸润是糖尿病肾病的重要特征[2]。我们研究组前期工作发现，在链脲菌素(STZ)诱导的DN大鼠早期损伤阶段，肾组织中主要以M1型巨噬细胞浸润为主，并且其活化与足细胞结构蛋白丢失密切相关[3]。然而，巨噬细胞对DN足细胞凋亡的作用尚不清楚。本研究采用高糖活化的巨噬细胞培养上清液刺激足细胞，探究巨噬细胞与足细胞体外相互作用，阐明巨噬细胞在糖尿病肾病足细胞凋亡中的作用及其内在机制。
小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购自上海博古生物科技有限公司。小鼠永生系足细胞MPC5由南京医科大学张爱华教授惠赠。RPMI-1640培养基，0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)，胎牛血清(FCS，美国Sciencell)，γ-干扰素(美国Perprotech)，Ⅰ型胶原(美国SantaCruz)，右旋葡萄糖、甘露醇、活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制剂Tempo (美国Sigma)，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)抑制剂SB203580、抗肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factor-α，TNF-α)中和抗体、中和抗体同型对照剂IgG、小鼠重组TNF-α(美国RD)、抗诱导型氮氧化物合酶(induced nitrogen monoxide synthase, iNOS)抗体(美国SantaCruz)，抗甘露糖受体(Mannose Receptor，MR)抗体(英国Abcam), 抗活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (cleaved caspase 3)抗体、抗磷酸化p38MAPK(phosphorylated-p38 MAPK，p-p38MAPK)抗体、抗p38MAPK抗体(美国CST)，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(美国RD)，Hoechst-33342染料(中国碧云天)，2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)染料(美国Sigma)，TNF-α ELISA试剂盒(中国欣博盛)。
Raw264.7细胞复苏后加入含10% FCS的RPMI-1640培养液，于37℃ 5%CO2培养箱中培养，隔天换液。干预前予以无血清RPMI-1640培养液同步化12 h。 巨噬细胞实验分组： 正常11.1 mmol/L葡萄糖组(NC)、25 mmol/L甘露糖组(Man)、25 mmol/L高糖组(HG)。
取Raw264.7接种于六孔板，同步化后分别予以正常葡萄糖、25 mmol/L高糖的RPMI-1640培养液培养24 h。弃上清液，予以PBS轻轻冲洗3次除去高糖和细胞碎片等，再予以新鲜RPMI-1640培养液培养24 h。24 h后分别收集上清液，2000 rpm离心5 min后留取上清，予以0.22 μm无菌滤膜过滤，即获得正常葡萄糖孵育的巨噬细胞培养上清液NC-CM和高糖活化的巨噬细胞培养上清液HG-CM。放于－70℃保存备用。
MPC细胞复苏后，接种至含10%FCS和10 U/ml γ-干扰素的RPMI-1640培养液中，在33℃、5%CO2培养箱培养，隔天换液。当细胞长至80%左右融合时，予以0.25%胰蛋白酶消化，将传代的足细胞移入不含有γ-干扰素的培养液，置于37℃、5% CO2培养箱培养，隔天换液，待其分化10～14天分化为成熟足细胞后用于实验。干预前将分化好的足细胞给予1%FBS低血清培养液中同步化12 h。足细胞实验分组：正常葡萄糖浓度对照组(NC)、NC-CM干预组、HG-CM干预组分别干预24～72 h，HG-CM＋300 μmol/L ROS抑制剂组(HG-CM＋Tempo)，HG-CM＋10 μmol/L p38MAPK抑制剂组(HG-CM＋SB203580)，HG-CM＋10 μg/ml抗TNF-α中和抗体组(HG-CM＋TNF-α neutralizing antibody)，HG-CM＋10 μg/ml中和抗体对照剂IgG组(HG-CM＋IgG)，10 ng/ml重组小鼠TNF-α组干预72 h。
按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书对细胞进行处理，标记好序号后将100 μl细胞悬液转移至细胞5 ml流式细胞仪上样管中，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混匀后于室温避光反应15 min，每管加入400 μl结合缓冲液，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
细胞干预结束后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次×5 min，加入适当量Hoechst-33342染色液充分覆盖细胞，室温放置5 min，弃染色液，用PBS洗3次×5 min，在荧光显微镜下观察荧光染色，拍照。
细胞干预结束后，无血清培养液洗1次，加入预温的50 μmol/L DCFH-DA染色液混匀，置于37℃ CO2培养箱避光3 h。去除DCFH-DA染色液，用预温的PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察荧光强度，拍照；常规消化DCFH-DA染色后的足细胞，用预温的PBS冲洗3次，反复吹打成单细胞悬液，用流式细胞仪测定荧光值。
细胞干预结束后4℃预冷的PBS洗3次×5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次×5 min，0.5%Triton-X100穿孔30 min，PBS漂洗3次×5 min，1%BSA封闭60 min，加入PBS稀释的一抗，4℃过夜，次日PBS洗3次×5 min，再加入PBS稀释的二抗，避光孵育2 h，PBS洗3次×5 min，加入DAPI核染液孵育5 min，PBS洗3次×5 min，激光共聚焦显微镜下观察，照相。
提取各组巨噬细胞培养上清液(NC-CM、HG-CM)各100μl按照小鼠ELISA试剂盒说明书操作步骤加样，最后在450 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上找到各吸光度所对应的细胞因子浓度。
按照细胞全蛋白抽提试剂盒说明书(南京凯基)提取细胞总蛋白，以测定iNOS、MR、cleaved caspase 3、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白表达。预冷PBS清洗细胞3次，按照200 μl/孔加入蛋白裂解液冰浴条件下充分裂解细胞，4℃，10 000 rpm离心10 min，去除沉淀，留取上清。按照BCA法蛋白定量测试盒(南京凯基)说明书测定各组蛋白浓度。 20 μg总蛋白SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1h，TBS洗膜3次×5 min分别加入一抗(兔抗小鼠iNOS抗体、兔抗小鼠MR抗体、兔抗小鼠cleaved caspase-3抗体、兔抗小鼠p-p38MAPK抗体和兔抗小鼠p38MAPK抗体)。4℃过夜，次日PBST洗膜3次×5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次×5 min。ECL显色(英国GEHealthcare)，胶片扫描后用Quantity One软件分析灰度值，并计算与β-actin的比值。
采用SPSS 16.0统计软件进行。计量资料以
±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
Western印迹结果显示，与对照组相比，25 mmol/L葡萄糖干预巨噬细胞24 h后，巨噬细胞高表达M1型巨噬细胞特异性标志物iNOS，而M2型细胞标志物MR表达减少(P<0.05，图1A、B)。细胞免疫荧光结果显示，高糖组巨噬细胞iNOS表达增多，MR表达降低(图1C)。
注：iNOS：诱导型氮氧化物合酶Inducible nitric oxide synthase；MR：甘露糖受体Mannose receptor；NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；Man组：25 mmol/L甘露糖组25 mmol/L mannose group；vs NC，aP<0.05
正常对照组与NC-CM组两组在各个时间点足细胞凋亡水平差异无统计学意义(P>0.05，图2A-C)。与对照组和NC-CM组相比，HG-CM组足细胞凋亡呈时间依赖性上调，在72 h足细胞凋亡达到最大值(P<0.05，图2A-C)。Western印迹结果显示，与对照组和NC-CM组相比，HG-CM组足细胞cleaved caspase-3蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。
注：NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；CM：巨噬细胞培养上清液干预Treated with conditioned media of macrophage；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；vs NC，aP<0.05；vs NC-CM，bP<0.05
与正常对照组相比，NC-CM组足细胞ROS、p-p38MAPK水平比较差异无统计学意义(P>0.05，图3A-D)。与对照组和NC-CM组相比，HG-CM组足细胞ROS产生明显增加，p-p38MAPK蛋白表达增多，p-p38MAPK/p38MAPK比值上调(P<0.05，图3A-D)。
注：NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；CM：巨噬细胞培养上清液干预Treated with conditioned media of macrophage；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；DCFH-DA：2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐2′，7′-dichlorofluorescin diacetate；p-：磷酸化Phosphorylated；p38MAPK：p38丝裂原活化蛋白激酶p38 Mitogen activated protein kinase；vs NC，aP<0.05；vs NC-CM，bP<0.05；vs HG-CM，cP<0.05
与HG-CM组相比，Tempo能减少HG-CM诱导的足细胞ROS产生(P<0.05，图3A、B), SB203580能抑制HG-CM诱导的足细胞p-p38MAPK表达(P<0.05，图3C、D)。Annexin V-FITC/PI染色和Hoechst-33342染色结果显示，与HG-CM组相比，HG-CM＋Tempo和HG-CM＋SB203580组足细胞凋亡明显减少(P<0.05，图4A、B和图4E)。Western印迹结果显示，HG-CM＋Tempo和HG-CM＋SB203580组足细胞cleaved caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05，图4C、D)。
注：NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；CM：巨噬细胞培养上清液干预Treated with conditioned media of macrophage；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；Cleaved caspase-3：活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；vs NC，aP<0.05；vs NC-CM，bP<0.05；vs HG-CM，cP<0.05
ELISA检测结果显示，巨噬细胞上清液HG-CM中促炎性细胞因子TNF-α显著升高(P<0.05，图5A)。Western印迹结果显示，巨噬细胞予以高糖刺激后，其TNF-α蛋白表达明显增加(P<0.05，图5B、C)。
注：TNF-α：肿瘤坏死因子-α Tumor necrosis factor-α；NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；CM：巨噬细胞培养上清液干预Treated with conditioned media of macrophage；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；Man组：25 mmol/L甘露糖组25 mmol/L mannose group；vs NC，aP<0.05；vs NC-CM，bP<0.05
与HG-CM组相比，抗TNF-α中和抗体能显著减少HG-CM诱导的足细胞凋亡，降低cleaved caspase-3蛋白表达(P<0.05，图6A-E)。同时，抗TNF-α中和抗体明显下调HG-CM诱导的足细胞ROS以及p-p38MAPK表达(P<0.05，图6F-I)。重组小鼠TNF-α单独刺激足细胞后，足细胞ROS产生明显增多，p-p38MAPK蛋白表达增加，细胞凋亡和cleaved caspase-3蛋白表达均明显上调(P<0.05，图6A-I)。
注：NC：正常葡萄糖对照组Normal glucose control group；CM：巨噬细胞培养上清液干预Treated with conditioned media of macrophage；HG：25 mmol/L高糖组25 mmol/L high glucose group；Cleaved caspase-3：活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；DCFH-DA：2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐2′，7′-dichlorofluorescin diacetate；p-：磷酸化Phosphorylated；p38MAPK：p38丝裂原活化蛋白激酶p38 Mitogen activated protein kinase；TNF-α：肿瘤坏死因子-α Tumor necrosis factor-α；TNF-α neutralizing antibody：TNF-α中和抗体；vs NC，aP<0.05；vs NC-CM，bP<0.05；vs HG-CM，cP<0.05
肾小球足细胞损伤是DN早期重要病理特征。在DN患者的肾穿刺标本中发现肾组织均存在明显的足细胞凋亡[4]。动物研究发现，足细胞凋亡早于蛋白尿的发生和足细胞数量的减少[5]，提示足细胞凋亡是DN足细胞损伤的早期中心环节。最近的研究表明，足细胞损伤与DN肾组织巨噬细胞浸润与活化密切相关[6]。
糖尿病肾病是一种慢性炎症性疾病[7]。巨噬细胞在慢性炎症性疾病的发病中起着重要作用[8]。研究发现，DN肾组织存在大量巨噬细胞浸润[9]。浸润的巨噬细胞与肾脏固有细胞存在相互作用。巨噬细胞促进系膜细胞基质增生和小管细胞凋亡，最终导致肾组织结构破坏、功能丧失[10,11]。我们研究组早期研究也发现，巨噬细胞能通过其表面CD18分子和肾小管细胞表面分子ICAM-1交互作用，促进小管细胞高表达促纤维化因子TGF-β，进而促进肾脏纤维化的发生发展[12]。至今也有不少研究对巨噬细胞与足细胞之间相互作用进行了探索。You等[6]发现，耗竭糖尿病肾病小鼠巨噬细胞能显著减轻足细胞结构蛋白nephrin和podocin表达的丢失，维持足细胞的正常结构和功能。体外研究发现，经典活化促炎性M1型巨噬细胞而不是替代活化促修复性M2型巨噬细胞降低足细胞结构蛋白表达，破坏足细胞渗透性。我们研究组前期工作发现，早期DN大鼠肾组织M1型巨噬细胞活化与足细胞结构损伤密切相关[13]。本研究在前期工作基础上进一步发现，高糖状态下，巨噬细胞呈M1型活化，该巨噬细胞培养上清液(HG-CM)能诱导足细胞发生凋亡。此外，正常葡萄糖孵育的巨噬细胞培养上清液(NC-CM)并不能诱导足细胞凋亡，提示静止状态的巨噬细胞对足细胞损伤没有作用。这与Wang等[14]人研究结果相一致，他们的研究发现，回输巨噬细胞能否诱导肾脏损伤与巨噬细胞活化状态密切相关。
因此，以上研究结果提示，糖尿病肾病状态下，巨噬细胞M1型活化后能诱导足细胞发生凋亡。
细胞凋亡，即细胞程序性死亡，在正常生理状态下清除衰老和突变的细胞，维持细胞正常的新陈代谢平衡。在病理状态下，异常的细胞凋亡会导致多种肾脏疾病的发生。细胞凋亡存在三条主要通路，即死亡受体通路、内质网通路和线粒体通路[15]。最近研究发现，氧化应激是介导足细胞凋亡的关键事件。糖尿病状态下，足细胞氧化应激被激活，释放大量ROS，激活其下游促凋亡信号分子p38MAPK，上调p-p38MAPK表达，促进足细胞凋亡[16]。临床研究和动物实验发现，DN肾组织足细胞p-p38MAPK明显增强[17,18]。过度活化的p38MAPK与蛋白尿、肾小球病理损伤密切相关[19]。特异性阻断足细胞氧化应激产生能显著减少DN足细胞凋亡，减轻肾脏组织病理损伤[20]。此外，特异性敲除p38MAPK活化的关键酶MKK，阻断p38MAPK活化，能显著降低DN足细胞凋亡，减轻蛋白尿，改善肾功能[21]。这些研究提示，ROS-p38MAPK信号通路在DN足细胞凋亡过程中具有重要作用。本研究发现，高糖活化的M1型巨噬细胞培养上清液(HG-CM)干预足细胞后，能明显增加足细胞ROS产生，促进p-p38MAPK表达，激活p38MAPK信号。ROS抑制剂和p38MAPK抑制剂能显著降低HG-CM介导的足细胞凋亡。这些结果提示，高糖活化的巨噬细胞能通过释放某一或某些因子激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路从而促进足细胞凋亡。
研究发现，糖尿病大鼠肾组织和尿液标本中TNF-α水平明显增高，并且早于蛋白尿的出现[22]。TNF-α可由多种细胞产生，包括炎症细胞和肾脏固有细胞[23]。研究表明，巨噬细胞是TNF-α的重要来源。特异性敲除巨噬细胞TNF-α能明显降低DN蛋白尿水平，改善肾功能，减轻肾脏组织病理学损伤[24]。体外研究发现，活化的巨噬细胞通过释放TNF-α而非IL-1 β破坏足细胞骨架蛋白[25]。我们的研究发现，高糖活化的M1型巨噬细胞培养上清液(HG-CM)中TNF-α表达水平明显增多。抗TNF-α中和抗体能显著降低HG-CM介导的足细胞凋亡，同时抑制ROS产生和p-p38MAPK表达。此外，TNF-α单独作用于足细胞也能增加足细胞ROS和p-p38MAPK表达，诱导足细胞凋亡。以上结果说明，高糖活化的M1型巨噬细胞通过释放TNF-α激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路，从而促进足细胞凋亡。但是我们还发现，抗TNF-α中和抗体并不能完全阻断HG-CM介导的足细胞凋亡，提示可能存在其它巨噬细胞来源的效应分子介导足细胞凋亡。而这些效应分子的作用及其潜在作用机制仍需要在未来的研究中一一阐明。
综上所述，本研究发现高糖状态下活化的M1型巨噬细胞释放TNF-α，激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路进而诱导足细胞凋亡。因此，阻断巨噬细胞M1型活化，抑制其释放TNF-α将成为防治糖尿病肾病足细胞凋亡的新策略。
探讨巨噬细胞在糖尿病肾病(DN)足细胞凋亡中的作用及其机制。
体外培养小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)，将其分为3组：正常葡萄糖组(NC)、甘露糖组(Man)、高葡萄糖组(HG)，并收集上述NC组巨噬细胞上清液(NC-CM)和HG组巨噬细胞上清液(HG-CM)。采用Western印迹和免疫荧光染色检测M1型巨噬细胞标志物iNOS和M2型巨噬细胞标志物MR表达，ELISA检测巨噬细胞上清液中TNF-α水平。体外培养小鼠永生系足细胞MPC5，将其分为以下几组：正常葡萄糖对照组(NC)、NC-CM组、HG-CM组、HG-CM＋ROS抑制剂组(HG-CM＋Tempo)、HG-CM＋p38MAPK抑制剂组(HG-CM＋SB203580)、HG-CM＋抗TNF-α中和抗体组(HG-CM＋TNF-α neutralizing antibody)、HG-CM＋中和抗体对照剂IgG组(HG-CM＋IgG)、重组小鼠TNF-α组。采用Annexin V-FITC/PI和Hoechst33342染色检测足细胞凋亡率，DCFH-DA染色检测足细胞ROS水平，Western印迹检测足细胞cleaved casepase-3、p38MAPK和p38MAPK磷酸化水平(p-p38MAPK)表达。
(1)与对照组相比，HG组巨噬细胞iNOS表达明显增加，MR表达降低，呈促炎性M1型活化。(2)正常对照组与NC-CM组组间足细胞凋亡、cleaved casepase-3、ROS及p-p38MAPK表达差异无统计学意义。与对照组和NC-CM组相比，HG-CM组足细胞凋亡、cleaved casepase-3、ROS及p-p38MAPK明显增加。(3)与HG-CM组相比，HG-CM＋Tempo，HG-CM＋SB203580组足细胞凋亡和cleaved casepase-3表达明显降低。(4)巨噬细胞上清液HG-CM中TNF-α水平较NC-CM明显增加，且予以高糖刺激后，巨噬细胞TNF-α表达明显增多。(5)与HG-CM组相比，加入抗TNF-α中和抗体能显著减少足细胞凋亡，抑制cleaved casepase-3、ROS及p-p38MAPK表达。(6)单独TNF-α刺激明显上调足细胞凋亡，增加ROS和p-p38 MAPK表达。
高糖状态下活化的M1型巨噬细胞释放TNF-α，激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路进而诱导DN足细胞凋亡。