各种糖尿病小鼠模型为人类糖尿病的研究提供了有价值的研究工具[1]。最常见的用于转基因小鼠构建的小鼠品系包括FVB，Sv129，DBA及C57BL/6等。在产生转基因小鼠模型的过程中常导致复杂的小鼠遗传背景。然而，大量研究显示小鼠品系背景对β细胞功能及糖调节作用具有重要影响[2,3]。目前在C57BL/6J小鼠与129Sv、DBA[4]、AKR[5]等小鼠的对比研究中发现C57BL/6J小鼠具有明显的糖代谢异常，对高脂喂养反应好，是构建饮食诱导肥胖(diet induced obesity，DIO)或糖耐量受损的良好模型[6]，使得它在代谢疾病研究中应用广泛。
现已明确，The Jackson Laboratory公司的C57BL/6小鼠在1984年被发现部分存在编码烟酰胺核苷酸转氢酶基因(NNT)5个外显子的自然丢失，形成了目前被广泛用于代谢研究C57BL/6J小鼠[6,7]。相反，C57BL/6N小鼠(Charles River公司销售的C57BL/6小鼠)不带有这种基因突变。目前认为NNT基因的大片段缺失突变可能是直接造成C57BL/6J小鼠高脂喂养下容易出现代谢失调的主要原因，但其中机制存在争议。有研究指出，与携带野生型NNT基因的小鼠相比，C57BL/6J小鼠表现出受损的糖耐量水平；在C57BL/6J小鼠中转入NNT基因后可以纠正β细胞功能和受损的糖耐量[8]。而Wong等[9]的研究显示在C57BL/6J与C57BL/6N小鼠中糖耐量水平及胰岛素分泌能力并无明显差异。NNT为一种参与NADPH形成的线粒体酶，对清除线粒体内超氧化物聚积，三磷酸腺苷合成的功能维持具有调控作用[5,7]。同时，文献报道超氧化物的形成参与了胰岛素抵抗，导致肥胖及糖耐量受损[10]。在国内代谢研究这方面的报道较少，然而C57BL/6J在代谢研究中应用广泛，我们希望比较国内的C57BL/6J和C57BL/6N是否也存在NNT基因的变异，并研究国内保种的这两系小鼠是否因此而有代谢差异。
8周龄SPF级C57BL/6J及C57BL/6N小鼠分别购自上海斯莱克公司和南京大学动物模式研究所。饲养条件控制在18℃～22℃，湿度50%～60%，12 h昼夜切换照明，自由饮水和摄食。
60%高脂饲料购自Research Diets公司；葡萄糖购自美国Sigma公司；短效胰岛素购自丹麦诺和诺德公司；TransDirect? Animal Tissue PCR Kit购自北京全式金生物技术有限公司，水平电泳槽购自美国Bio-rad公司，血糖仪及血糖试纸购自美国强生公司，DL2000 Marker购自Takara公司，Gelred购自北京中科泰瑞生物科技有限公司，台式紫外显影仪购自美国VWR公司。
8周龄性成熟C57BL/6J小鼠与C57BL/6N小鼠雌雄合笼，所生小鼠满3周龄时进行编号分笼，取鼠趾用于后续基因型鉴定。将获得的F1代杂合子小鼠在8周时继续进行交配，最终获得NNT＋/＋、NNT＋/－、NNT－/－3型小鼠。将3种不同NNT基因型的后代从4周起随机予以高脂饮食或对照饮食4周，每周监测小鼠体重。
取干净的剪刀将组织剪碎后加入40 μl AD1 buffer和10 μl AD2 buffer，室温孵育10 min后，加热到95℃，加热3 min，冷却至室温后，加入40 μl AD3 buffer，混匀后直接用于基因型PCR鉴定。
野生型NNT(NNT Exon 8)为5′-CC-AGGCGAGCACTCTCTATT-3′和5′-CAGGGTCACAGGA-GAACACA-3′；突变型NNT(NNT Exon 6-12)为5′-GTA-GGGCCAACTGTTTCTGC-3′和5′-TCCCCTCCCTTCCAT-TTAGT-3′。
配制2%琼脂糖凝胶，依次加入DNA marker与PCR扩增产物，在140伏电压下电泳，在台面式紫外显影仪下观察结果。
将要做实验的小鼠过夜禁食16～18 h后，给予腹腔注射葡萄糖(2 g/kg体重)，在注射葡萄糖之前(0 min)以及注射后的15 min、30 min、60 min以及120 min时间点分别从尾静脉采血，检测血糖水平。
早上8∶00开始将要做实验的小鼠禁食，6 h后，待下午14∶00时，给予腹腔注射胰岛素(1 U/kg体重)，在注射胰岛素之前(0 min)以及注射后的15 min、30 min、45 min以及60 min时间点分别从小鼠尾静脉采血，检测血糖水平。
用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以 
±s 表示。所示数据n为3～20。两组间比较符合正态分布资料采用独立样本t检验(independent-sample t test)，3组及以上数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著性水平为0.05。
NNT突变小鼠与对照组的遗传背景不同是导致有关NNT基因研究结论存在异质性的重要原因之一。为了避免出现背景信号的混杂，我们并未直接比较带有NNT突变的C57BL/6J与不带突变的C57BL/6N小鼠的表型差异，而是将这两种小鼠交配后得到混杂背景的小鼠，并取其中的NNT杂合小鼠进行交配。从而其后代可同时存在NNT野生型(NNT＋/＋)，NNT杂合突变型(NNT＋/－)及NNT纯合突变型(NNT－/－)。
C57BL/6J小鼠第13号染色体7～11号外显子缺失，在无NNT缺失的情况下可以扩增出第8号外显子的引物片段，大约在150 bp左右的位置；而突变序列因为大片段DNA序列缺失，使第6与第12号外显子相连，突变型NNT的引物(Exon 6-12)可以扩增出大约为550 bp的大片段缺失后融合的突变DNA序列(图1)。
注：NNT：烟酰胺核苷酸转氢酶nicotinaide nucleotide transhydrogenase；胶图右侧为扩增NNT6-12外显子融合突变条带在550 bp附近，左侧是扩增NNT8号外显子野生条带在150 bp附近。NNT突变小鼠基因型可见NNT6-12突变条带，而未见正常8号外显子扩增条带。NNT野生型小鼠可见正常8号外显子扩增条带，未见NNT6-12突变条带。NNT杂合子小鼠可见两条扩增条带The band at 550 bp indicates the mutated NTT which lost fragment of DNA expanding from 6th to 12th exon, while the band at 150 bp indicates the wild-type NNT with 8th exon intact
小鼠被用于后续实验的表型研究。
我们从4周龄小鼠体重进行连续观察至8周龄，结果显示在正常饮食喂养下，不同NNT基因型小鼠体重差异不大(图2A)；进行高脂饮食喂养4周后，3种NNT基因型小鼠体重仍然没有明显差异(图2B)，这提示在高脂喂养4周后，NNT突变对于体重的增加影响不大。
注：NNT：烟酰胺核苷酸转氢酶nicotinaide nucleotide transhydrogenase；NCD：正常饮食Normal control diet；HFD：高脂饮食High-fat diet
为了比较8周时不同基因型小鼠的糖耐量水平，我们分别对3组小鼠进行了经腹腔糖耐量试验。结果显示即使在正常饮食情况下，NNT－/－组小鼠在葡萄糖注射后30 min[NNT－/－ (23.70±1.26)对NNT＋/＋ (16.16±1.26) mmol/L，P<0.05]、60 min[NNT－/－ (15.12±2.29)对NNT＋/＋ (9.82±2.56) mmol/L，P<0.05]及120 min时[NNT－/－ (7.78±1.05)对NNT＋/＋ (6.27±1.18) mmol/L，P<0.05]，NNT突变小鼠血糖水平显著高于NNT＋/＋小鼠(图3A)。糖耐量曲线进行曲线下面积(area under curve, AUC)的计算显示NNT－/－小鼠的葡萄糖耐量明显差于NNT＋/＋小鼠[NNT－/－(1 795.50±111.60)对NNT＋/＋ (1 303.25±239.85) min×mmol/L，P<0.05，图3B]。上述结果证实，即使在正常饮食喂养状态下，NNT突变小鼠具有更差的糖耐量。高脂饮食喂养4周进一步增加了NNT突变所致的小鼠糖耐量差异(图3C)。高脂饮食喂养4周后，NNT－/－小鼠的糖耐量AUC显著升高更为明显[NNT－/－ (2 331.50±94.19)对NNT＋/＋ (1 577.08±108.88) min×mmol/L，P<0.05，图3D]。
注：NNT：烟酰胺核苷酸转氢酶nicotinaide nucleotide transhydrogenase；NCD：正常饮食Normal control diet；HFD：高脂饮食High-fat diet；IPGTT：经腹糖耐量试验Intraperitoneal glucose tolerance test；A：正常饮食下不同NNT基因型小鼠IPGTT Glucose excursion curves of IPGTT in different NNT genotypes under NCD；B：正常饮食下不同NNT基因型小鼠IPGTT曲线下面积Area under curve of different NNT genotypes under NCD；C：高脂饮食下不同NNT基因型小鼠IPGTT Glucose excursion curves of IPGTT in different NNT genotypes under HFD；D：高脂饮食下不同NNT基因型小鼠IPGTT曲线下面积Area under curve of different NNT genotypes under HFD；vs NNT＋/＋，aP<0.05
我们进一步分析NNT＋/＋与NNT－/－小鼠高脂喂养4周后糖耐量各自变化的情况。结果显示在高脂喂养早期NNT＋/＋与NNT－/－小鼠与其同基因型但正常饮食小鼠相比均可出现一定的糖耐量受损(图4)，可见NNT突变小鼠在代谢压力下糖耐量改变较野生型小鼠明显。NNT＋/＋小鼠在高脂喂养4周后，经腹葡萄糖注射后30 min、60 min及120 min时血糖与正常饮食同基因型小鼠相比血糖均显著升高(P<0.05，图4A)。通过AUC的分析，进一步肯定了以上结果[NNT＋/＋小鼠NCD的AUC(1 303.25±239.85)对HFD(1 577.083 3±108.88) min×mmol/L，P<0.05，图4B]。而NNT－/－小鼠在高脂喂养4周后除葡萄糖注射后30 min、60 min及120 min出现差异外，在葡萄糖注射后15 min，高脂喂养的突变小鼠与正常饮食NNT－/－小鼠相比，血糖亦出现显著差异[NCD的血糖(20.17±2.76)对(23.90±1.93) mmol/L，P<0.05，图4C]，提示高脂喂养可能更容易使NNT突变小鼠发生糖耐量受损。通过AUC的分析，进一步肯定了以上结果[NNT－/－小鼠NCD的AUC(1 759.50±111.60)对HFD(2 331.50±94.19) min×mmol/L，P<0.05，图4D)。值得注意的是，NNT＋/－小鼠在高脂喂养早期其糖耐量改变与NNT＋/＋小鼠相似，经腹葡萄糖注射后15 min，NNT＋/－小鼠血糖水平出现升高但无统计学差异，而在30 min及60 min时间点，高脂喂养的NNT＋/－小鼠血糖水平较正常饮食时升高3 mmol/L左右[30 min时NCD血糖为(17.77±0.65)对HFD(21.18±2.61) mmol/L，P<0.05；60 min时NCD(11.82±3.93)对HFD(15.45±3.06) mmol/L，P<0.05，图4E]。通过AUC分析，进一步肯定了NNT＋/－小鼠在高脂喂养早期其糖耐量改变与NNT＋/＋小鼠相似[NNT＋/－小鼠NCD的AUC(1371.65±217.46)对HFD(1782.69±99.17) min×mmol/L，P<0.05，图4F]。以上数据表明NNT突变相对NNT野生型小鼠，更易产生高脂喂养所致的糖耐量受损，糖耐量受损程度更高。而NNT杂合子小鼠代谢表型更接近于野生型小鼠。
注：NNT：烟酰胺核苷酸转氢酶nicotinaide nucleotide transhydrogenase；NCD：正常饮食Normal control diet；HFD：高脂饮食High-fat diet；IPGTT：经腹糖耐量试验Intraperitoneal glucose tolerance test；NNT＋/＋(A)、NNT－/－(C)及NNT＋/－(E)小鼠不同饮食下糖耐量曲线Comparison between NCD and HFD in NNT＋/＋(A)、 NNT－/－(C) and NNT＋/－(E)mice；NNT＋/＋(B)、NNT－/－(D)及NNT＋/－(F)小鼠不同饮食下糖耐量曲线下面积计算Area under curve of IPGTT between NCD and HFD in NNT＋/＋(B)、NNT－/－(D)and NNT＋/－(F)mice；vs NCD, aP<0.05
如前所述，NNT突变可能影响了胰岛素敏感性。为明确不同NNT基因型小鼠的胰岛素敏感性，我们对3组小鼠进行了胰岛素耐量测试。结果显示在正常饮食的情况下8周龄NNT突变小鼠注射胰岛素后，120 min内血糖较空腹时的下降幅度相似，提示不同NNT基因型小鼠的胰岛素敏感性在正常饮食下没有显著差异(图5A)。在正常饮食喂养下，不同NNT基因型的小鼠AUC无明显差异(NNT－/－ 4 181.88±228.44对NNT＋/＋ 3 910.17±643.12，P＝0.87，图5B)。而在高脂喂养后，我们注射胰岛素后，在30 min(NNT－/－ 79.44%±7.48%对NNT＋/＋ 66.06%±3.19%，P<0.05)及60 min时间点上(NNT－/－ 81.07%±15.45%对NNT＋/＋ 57.06%±7.78%，P<0.05，图5C)，AUC结果显示整个ITT试验中，NNT－/－小鼠血糖下降总体程度较NNT＋/＋小鼠减弱(NNT－/－ 5 511.74±581.14对NNT＋/＋ 4 434.48±444.46，P<0.05，图5D)，提示在同样高脂喂养的代谢压力下NNT突变小鼠的胰岛素敏感性下降比较显著。
注：NNT：烟酰胺核苷酸转氢酶nicotinaide nucleotide transhydrogenase；NCD：正常饮食Normal control diet；HFD：高脂饮食High-fat diet；IPGTT：经腹糖耐量试验Intraperitoneal glucose tolerance test；A：正常饮食下不同NNT基因型小鼠ITT Glucose declination curve of ITT in different NNT genotypes under NCD；B：正常饮食下不同NNT基因型小鼠ITT曲线下面积Area under curve of different NNT genotypes under NCD；C：高脂饮食下不同NNT基因型小鼠ITT Glucose declination curve of ITT in different NNT genotypes under HFD；D：高脂饮食下不同NNT基因型小鼠ITT曲线下面积Area under curve of different NNT genotypes under HFD；vs NNT＋/＋，aP<0.05
本研究将遗传背景接近的携带NNT野生型的C57BL/6N与携带NNT突变型的C57BL/6J小鼠交配，再将其杂合子子代交配，得到了6J和6N混合背景的不同NNT基因型的小鼠。可以看到NNT突变型小鼠表现出明显的糖耐量受损及在高脂饮食诱导下胰岛素敏感性降低，而野生型与杂合子小鼠糖代谢特征并无明显差异。
NNT突变对于维持机体糖代谢稳态具有重要作用。Freeman等[11]在小鼠胰岛素瘤细胞系(MIN6)细胞中干扰掉NNT的表达后，细胞分泌胰岛素的能力减弱，而在NNT突变的小鼠内转入NNT基因后，糖刺激胰岛素分泌功能改善[8]。然而，最近报道发现C57BL/6N与C57BL/6J小鼠胰岛分离并在体外予不同糖浓度刺激，其糖刺激胰岛素分泌并无明显差异[9]。NNT失活，NADPH作为体内重要的供氢体生成减少，去除线粒体内的活性氧能力降低[5,7]。与此同时，日益增多证据表明线粒体数量及功能的改变与胰岛素抵抗相关，当细胞内以活性氧为代表的氧化压力增强时，线粒体发生改变同时通过引起蛋白质，脂质及DNA损伤减弱线粒体的功能[12]。因此我们研究发现NNT突变的小鼠在高脂饮食的诱导下胰岛素敏感性明显受损，可能是由于NNT突变失活后细胞内活性氧增多而引起。
我们的研究发现NNT＋/＋的小鼠与NNT＋/－小鼠在正常饮食和高脂饮食喂养后糖耐量及胰岛素敏感性并无明显差异，这与Attané等[13]的研究结果一致。Attané等[13]将C56BL/6J来源的转基因小鼠与C56BL/6N来源的MIP-CRE-ERT(MCre)小鼠交配，选取同样具备C56BL/6J和C56BL/6N(混合背景)F2代的NNT＋/＋与NNT＋/－的小鼠用于后续实验，发现NNT＋/＋与NNT＋/－的小鼠在正常饮食及高脂喂养12周后两组小鼠体重、葡萄糖耐量及胰岛素敏感性无明显差异。然而与NNT＋/＋小鼠相比，NNT＋/－小鼠的糖刺激胰岛素分泌功能明显减弱。我们在高脂喂养4周后，NNT＋/－与NNT＋/＋糖耐量曲线接近，然而，糖耐量15 min的血糖出现升高趋势。如果高脂喂养时间延长，或能看到NNT＋/－相比NNT＋/＋出现更严重糖耐量受损。因此，NNT杂合子的代谢表型在长期高脂喂养的实验中，依然有可能成为影响表型的混杂因素。
最近，Toye等[5]通过eQTL结果分析研究，发现至少有3个基因座位与C57BL/6J小鼠的糖耐量受损有关，NNT基因突变只是其中之一。因此解释了这之前研究结果相互矛盾的原因。而我们的研究尽可能排除其他基因座位的影响同时，采用了相同亲代来源的不同基因型小鼠进行研究，最大可能保证了遗传背景的一致性。
综上，我们的实验表明NNT基因突变对C57BL/6小鼠的糖代谢表型具有不可忽略的影响，有可能同时损伤胰岛β细胞的分泌以及周围组织的胰岛素敏感性。我们认为在各项代谢实验中，尤其是2型糖尿病发病机制相关的研究，应保持对小鼠背景和NNT基因型的警惕。如果在实验前没有明确小鼠是否携带有NNT基因突变，会对糖代谢的研究带来干扰。尤其国内代谢研究越来越多运用不同的转基因小鼠，这些小鼠来源繁杂，以C57BL/6J为背景的居多，使得对照或野生型的同窝对照小鼠也有可能存在糖代谢异常。因此，根据不同的实验设计，我们有必要在实验前明确小鼠的遗传背景，确认C57BL/6小鼠的亚类以及是否存在NNT突变，建议根据不同实验目的选择不同C57BL/6亚类。
探讨烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT)基因突变对于C57BL/6小鼠糖代谢稳态的影响。
将无NNT突变的野生型C57BL/6N与携带NNT突变C57BL/6J小鼠交配，F1代杂合小鼠继续交配，得到NNT纯合野生型，NNT纯合突变型，及NNT突变杂合子3种不同NNT基因型的F2代。小鼠4周龄起分别给予高脂饮食或对照饮食4周，每周监测小鼠体重。在小鼠8周时称重，并通过经腹糖耐量试验(IPGTT)检测小鼠糖代谢水平，通过经腹胰岛素耐量试验(ITT)检测小鼠胰岛素敏感性。
正常饮食或高脂饮食喂养4周后，不同F2代小鼠基因型三者体重并无差异，但是NNT突变小鼠糖耐量显著受损，并且在高脂饮食诱导下NNT突变小鼠胰岛素敏感性相对NNT野生型显著下降。而NNT杂合子小鼠糖代谢及胰岛素敏感性异常不显著。
NNT基因突变对C57BL/6小鼠的糖代谢表型具有重要影响，杂合突变和纯合突变表型迥异。C57BL/6J和C57BL/6N小鼠不同遗传背景对高脂饮食有不同反应，这是在进行实验设计时需要充分考虑的因素，可能与不同NNT基因型有关。在研究代谢的实验中尽量保持受试小鼠遗传背景的一致，将对实验结果的解释具有重要作用。