自身免疫性甲状腺疾病治疗过程中，抗甲状腺药物(anti-thyroid drugs, ATDs)及左旋甲状腺素(levothyrocine, LT4)对甲状腺功能的改善，可同时伴有促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb)的浓度改变，甚至是甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibody，TSAb)和甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulating blocking antibody, TSBAb)之间的相互转换。TRAb的这两个种类引发不同的临床综合征，TSAb与TSHR结合后模拟TSH的作用，通过激活腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷(AC-cAMP)通路，刺激甲状腺滤泡生长和甲状腺激素合成、分泌，导致甲状腺功能亢进(甲亢)。TSBAb与TSHR结合后可阻断TSH对甲状腺的刺激作用，可引起甲状腺功能减退(甲减)的发生。我们通过实验室建立的人血清酶联免疫吸附(ELISA)技术[1,2,3]，回顾观察了抗甲状腺药物及治疗过程中LT4对于TSAb及TSBAb的影响。
1. 本文是回顾性分析，从2011年至2014年天津医科大学总医院门诊及病房收治的甲状腺疾病患者中，选取了117例发病前TRAb-N(以TSAb为主)阳性的Graves甲亢患者，规律定期随访36个月。入组标准：符合2007年中国甲状腺疾病诊疗指南Graves病诊断标准，必备条件为：临床甲亢症状和体征，甲状腺弥漫性肿大(经甲状腺超声证实)，血清TSH浓度降低，甲状腺激素浓度升高。排除标准：甲状腺超声检查提示结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤、亚急性甲状腺炎或桥本甲状腺炎等不符合Graves病甲状腺超声表现的病例。
2. 分组标准：(1)根据TRAb-N变化趋势分为3组，Ⅰ组：持续TRAb-N(＋)；Ⅱ组：TRAb-N变化复杂、反复波动(波幅超过正常范围20%，波动2次以上)，其中Ⅱa组甲亢复发，Ⅱb组甲亢缓解(持续12个月以上甲状腺功能正常考虑缓解)；Ⅲ组：TRAb-N逐渐减少转阴，其中Ⅲa组甲亢复发，Ⅲb组甲亢缓解。治疗方案：ATDs均为赛治(Methimazole MMI)10～30 mg，各组之间无剂量差别。(2)根据是否联合LT4分为2组。A组：联合治疗组(41例)；B组：单一ATDs治疗组(76例)。联合方案：MMI起始剂量10～30 mg，治疗过程中根据甲状腺功能(TSH>10 mIU/L)联合小剂量LT4(6.25～25 μg/d)。最早第3个月开始联合LT4，至30个月(仅1例甲亢转为甲减患者持续服用，其余均停用)。
1. 本研究检测人血清TRAb的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术：分别以重组hTSHR膜外区氨基端片段融合蛋白(TrxFus.hTSHRn)和重组hTSHR膜外区羧基端片段融合蛋白(TrxFus.hTSHRc)为抗原包被96孔酶标板，加入患者血清37℃结合1 h，加入碱性磷酸酶标记羊抗人Ig(二抗)37℃结合1 h，最后pNPP显色剂显色，酶标仪测定405 nm处吸光度(A405)值[2]。
2. ELISA检测正常人血清TRAb-N吸光度值A405为(0.40±0.15)。正态性检验(K-S拟合优度检验)发现变量服从正态性分布，其阳性切限值(±2 s)为0.7。ELISA方法检测TRAb-C(以TSBAb为主)吸光度值A405为(0.44±0.17)，其阳性切限值(＋2 s)为0.78。游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)3.5～6.5 pmol/L，游离甲状腺素(FT4)11.5～23.5 pmol/L，促甲状腺激素(sTSH)0.3～5.0 mIU/L。
3. 观察指标：ATDs治疗Graves甲亢36个月，TRAb-N、TRAb-C变化；根据是否联合LT4观察对TRAb-N、TRAb-C的影响。
应用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析，数值变量资料为正态分布时，均数采用
±s，均数比较采用两样本t检验，各组间阳性率差异以χ2检验进行多组间比较，P<0.05有统计学差异。
根据TRAb-N变化趋势分为3组，一般情况比较：各组间性别、年龄、甲状腺肿大程度、治疗前甲状腺功能及治疗方案无明显差别(P>0.05，表1)。根据ATDs是否联合LT4分为2组，一般情况比较：各组间性别、年龄、治疗前甲状腺功能及治疗方案无明显差别(P>0.05，表2)。
 | 表1 根据TRAb-N变化趋势所分3组的基线 Tab 1 Baseline of 3 groups of patients according to the changes of TRAb-N |
根据TRAb-N变化趋势所分3组的基线
Baseline of 3 groups of patients according to the changes of TRAb-N
| 组别 Group | 例数 n | 性别(男/女) Sex(Male/Female) | 年龄 Age (岁) (Year) | 甲状腺肿大 Goiter | 治疗前 Before treatment | 甲巯咪唑不同首剂量病例数 Case number of different first dose of methimazole | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ⅰ° | Ⅱ° | Ⅲ° | FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TSH(mIU/L) | 5-10 mg | 15-20 mg | 25-30 mg | ||||
| Ⅰ | 10 | 0/10 | 45.00±13.04 | 4 | 6 | 0 | 19.90±9.46 | 75.83±43.46 | 0.00±0.00 | 2(20.0%) | 3(30.0%) | 5(50.0%) |
| Ⅱ | 17 | 2/15 | 38.18±18.42 | 6 | 10 | 1 | 18.35±9.23 | 68.08±44.77 | 0.02±0.04 | 2(11.8%) | 3(17.6%) | 12(70.6%) |
| Ⅲ | 89 | 26/63 | 39.11±13.75 | 40 | 48 | 1 | 17.46±8.37 | 60.76±37.92 | 0.03±0.17 | 7(8.0%) | 20(22.5%) | 61(68.5%) |
注：TRAb：促甲状腺素受体抗体TSH receptor antibody；Ⅰ组Ⅰ group：持续TRAb-N(＋) TRAb-N were positive continually；Ⅱ组Ⅱ group：TRAb-N变化复杂Changes of TRAb-N were complicated；Ⅲ组Ⅲ group：TRAb-N逐渐减少转阴TRAb-N droped off
 | 表2 根据ATDs是否联合LT4所分两组基线 Tab 2 Baseline of 2 groups of patients according to ATDs with and without LT4 |
根据ATDs是否联合LT4所分两组基线
Baseline of 2 groups of patients according to ATDs with and without LT4
| 组别 Group | 例数 n | 性别(男/女) Sex(Male/Female) | 年龄 Age (岁) (Year) | 治疗前 Before treatment | 甲巯咪唑不同首剂量病例数 Case number of different first dose of methimazole | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TSH(mIU/L) | 5-10 mg | 15-20 mg | 25-30 mg | ||||
| A | 41 | 10/31 | 45.0±13.0 | 19.34±9.60 | 65.81±39.83 | 0.06±0.24 | 2(4.8%) | 9(22.0%) | 30(73.2%) |
| B | 76 | 18/58 | 38.2±18.4 | 17.77±8.02 | 63.28±38.07 | 0.02±0.12 | 7(9.2%) | 20(26.3%) | 49(64.5%) |
注：ATDs：抗甲状腺药物Anti-thyroid drugs；LT4：左甲状腺素Levothyrocine；A组A group：ATDs联合LT4 ATDs combined with LT4；B组B group：单一ATDs Only ATDs
117例患者TRAb-N全部阳性，均值(1.01±0.29)，其中38例TRAb-C阳性，阳性率32.5%, TRAb-C均值(0.73±0.21)为阴性。本文为回顾性分析，我们根据TRAB-N变化趋势不同分为3组。Ⅰ组(图1A)：10例Graves甲亢患者治疗36个月中TRAb-N各值均持续阳性，治疗前TRAb-N均值(1.09±0.39)阳性、TRAb-C均值(0.67±0.90)为阴性，持续36个月甲亢未缓解。Ⅱ组(图1B)：17例Graves甲亢患者，治疗前TRAb-N均值(0.88±0.18)阳性、TRAb-C均值(0.76±0.12)阴性，治疗36个月中TRAb-N表现为变化复杂，反复波动，部分病例治疗期间甲亢及甲减状态反复，Ⅱa组：17例中12例，治疗36个月后甲状腺功能未能恢复正常，仍表现为甲亢，Ⅱb组：17例中5例，治疗36个月后甲亢缓解；Ⅱ组甲亢缓解率29.4%。Ⅲ组(图1C)：89例Graves甲亢患者，治疗前TRAb-N均值(1.02±0.29)阳性、TRAb-C均值(0.72±0.23)阴性，治疗期间TRAb-N逐渐减少至转阴，其中Ⅲa组15例甲亢未能缓解，Ⅲb组74例随着TRAb-N转阴，甲亢缓解，Ⅲ组缓解率83.1%。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组TRAB-N阳性且变化趋势不同(图1D)。3组TRAb-C均值均为阴性，呈逐渐下降趋势。根据治疗后甲亢缓解率，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组行χ2检验(χ2＝42.34，P<0.01)，3组间有统计学差异，3组TRAb-N变化趋势不同，甲亢缓解情况不同(表3)。
 | 表3 3组患者治疗前及治疗36个月后甲状腺功能数值 Tab 3 Thyroid function of 3 groups of patients before and after 36 months of treatment |
3组患者治疗前及治疗36个月后甲状腺功能数值
Thyroid function of 3 groups of patients before and after 36 months of treatment
| 组别 Group | 例数 n | 治疗前 Before treatment | 治疗后 After treatment | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TSH(mIU/L) | FT3(pmol/L) | FT4(pmol/L) | TSH(mIU/L) | ||
| Ⅰ | 10 | 19.90±9.46 | 75.83±43.46 | 0.00±0.00 | 6.12±1.98 | 21.41±7.31 | 0.01±0.14 |
| Ⅱa | 12 | 19.18±9.68 | 66.02±42.48 | 0.03±0.05 | 6.54±0.38 | 25.84±1.57 | 0.02±0.03 |
| Ⅱb | 5 | 16.38±7.38 | 73.04±54.88 | 0.01±0.13 | 5.76±0.59 | 19.42±2.34 | 1.72±0.69 |
| Ⅲa | 15 | 15.91±7.66 | 63.43±41.92 | 0.01±0.14 | 6.82±1.49 | 24.03±4.51 | 0.01±0.01 |
| Ⅲb | 74 | 17.78±8.52 | 60.22±37.34 | 0.34±0.18 | 4.51±0.54 | 16.22±2.31 | 2.17±1.02 |
注：TSH<0.0l者以0计算TSH<0.01 were calculated as 0；Ⅰ组Ⅰgroup：持续甲亢Continued to have hyperthyroidism；Ⅱa组12例甲亢复发，Ⅱb组5例缓解12 cases relapse in Ⅱa group, while 5 cases remission in Ⅱb group；Ⅲa组15例甲亢复发，Ⅲb组74例缓解15 cases relapse in Ⅲa group, while 74 cases remission in Ⅲb group
注：横坐标为时间(月份)Abscissa presents for time(month)，纵坐标为促甲状腺素受体抗体(TRAb)-N、TRAb-C数值Ordinate presents for TSH receptor antibody(TRAb)-N；(A)Ⅰ组Ⅰ group：持续TRAb-N(＋)TRAb-N were positive continually；(B)Ⅱ组Ⅱ group：TRAb-N变化复杂Changes of TRAb-N were complicated；(C)Ⅲ组Ⅲ group：TRAb-N逐渐减少转阴TRAb-N droped off；(D)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组TRAb-N均值变化趋势Change trend of the TRAb-C among 3 groups；(E)(F)1例患者TRAb-N阳性逐渐下降，TRAb-C持续阳性A patient with TRAb-N positive dropping off, TRAb-C were positive continually
其中1例TRAb-N阳性Graves甲亢患者(FT3 14.03 pmol/L，FT4 36.24 pmol/L，TSH 0.00 mIU/L)发展为TRAb-C阳性甲减(FT3 4.39 pmol/L，FT4 16.8 pmol/L，TSH 8.14 mIU/L)，图1E、F显示，此例患者起初以TRAb-N(1.42)为主导，逐渐下降至正常范围，而TRAb-C一直为高值略有下降，治疗后逐渐变为以TRAb-C(1.2)为主导。既往TRAb-N阳性甲亢，经给予MMI及LT4，36个月时转变为TRAb-C阳性甲减。
根据是否联合LT4分为2组，A组：联合治疗组(41例)；B组：单一ATDs治疗组(76例)。表4所示，基线和3个月时，TRAb-N于两组间具有统计学差异(P<0.01)；其他各时点两组间没有统计学差异(P>0.05)。观察指标TRAb-C，治疗30个月中，比较各时点两组间均没有统计学差异(P>0.05)。
 | 表4 ATDs治疗期间两组TRAb-N、TRAb-C变化 Tab 4 Changes of TRAb-N and TRAb-C between 2 groups during ATDs treatment |
ATDs治疗期间两组TRAb-N、TRAb-C变化
Changes of TRAb-N and TRAb-C between 2 groups during ATDs treatment
| 指标 Index | 组别 Group | 月 Month | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | 30 | ||
| TRAb-N | A(n＝41) | 0.92±0.21 | 0.82±0.22 | 0.76±0.22 | 0.66±0.20 | 0.56±0.21 | 0.51±0.19 | 0.48±0.18 |
| B(n＝76) | 1.06±0.32 | 0.95±0.29 | 0.83±0.24 | 0.71±0.25 | 0.61±0.22 | 0.57±0.21 | 0.52±0.21 | |
| TRAb-C | A(n＝41) | 0.71±0.14 | 0.70±0.24 | 0.67±0.20 | 0.57±0.23 | 0.45±0.16 | 0.36±0.13 | 0.31±0.12 |
| B(n＝76) | 0.75±0.22 | 0.74±0.24 | 0.68±0.23 | 0.58±0.19 | 0.47±0.16 | 0.38±0.10 | 0.33±0.10 | |
注：TRAb：促甲状腺素受体抗体TSH receptor antibody；ATDs：抗甲状腺药物Anti-thyroid drugs；A组A group：ATDs联合LT4 ATDs combined with LT4；B组B group：单一ATDs Only ATDs
长期以来，大多数学者认为不同功能的TRAb识别人促甲状腺素受体(TSHR)的不同表位，TSAb的抗原表位主要分布于TSHR膜外区的氨基端(N端)，而TSBAb的抗原表位主要位于TSHR膜外区的羧基端(C端)，但这些抗体在TSHR上的抗原表位均呈现出广泛性和非连续性多点分布，且相互重叠、穿插的特点，并与表位的三维空间构象有关[1,4,5]。通常检测TRAb试验分为两类，一类是基于竞争性分析的放射受体、酶联免疫分析法；另一类是测定cAMP产物的细胞生物学分析法。此法可区分TSAb和TSBAb，但方法烦琐，耗时且价格昂贵，通常只用于科研。在这篇回顾分析中，我们应用了实验室建立的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术：TRAb-N(ELISA)、TRAb-C(ELISA)检测方法来检测TSAb、TSBAb[1,2]。
观察117例TRAb-N阳性的Graves甲亢患者，治疗36个月过程中TRAb-N及TRAb-C的变化。117例患者中TRAb-N全部为阳性，而TRAb-C并非全部阴性，考虑刺激性抗体以及阻断性抗体可能在N端、C端有部分交叉重叠，因此可能有部分患者阻断性抗体呈阳性。根据TRAb-N变化趋势的不同分3组，Ⅰ组病例均持续TRAb-N阳性，TRAb-C阴性，甲亢持续状态未缓解。因此，TSAb持续阳性甲亢患者治疗疗程较长不易缓解。Ⅱ组病例TRAb-N变化复杂，反复波动，甲亢缓解率29.4%。而Ⅲ组病例TRAb-N逐渐减少至转阴，甲亢缓解率83.1%。Ⅱ组与Ⅲ组相比较，Ⅱ组甲亢缓解率明显低于Ⅲ组。因此，我们考虑TSAb反复波动、变化复杂的病例，更容易造成病程长，甲状腺功能不易恢复。此篇文章中可观察到大部分患者，如89例病例中74例随着TSAb逐渐减少而甲状腺功能恢复正常。1例TRAb-N(TSAb)甲亢发展为TRAb-C(TSBAb)阳性甲减，早期TSAb为主导，后来TSBAb为主导。因此，当TSAb、TSBAb混合浓度下降时，更高的浓度更高的亲和力就可能占主导地位，并改变临床表现。TSAb阳性甲亢患者和TSBAb阳性甲减患者可能均包含TSAb、TSBAb抗体[6,7]。TSAb阳性甲亢和TSBAb阳性甲减可能是一个疾病的两个方面[8,9]。
我们回顾性观察了在ATDs治疗中，联合LT4调节甲状腺功能对TSAb以及TSBAb的影响变化。我们观察到联合治疗组TRAb-N均值0.92±0.21，而单一ATDs治疗组TRAb-N均值1.06±0.32, TRAb-N均值较低一组在治疗中出现甲减并联用了LT4，两组比较P<0.01有统计学差异。在ATDs治疗中，治疗前TRAb-N数值较低患者，如果应用ATDs治疗剂量偏大或未及时调整ATDs剂量，易发生甲状腺功能波动及短暂甲减。在ATDs治疗3个月时，A组与B组TRAb-N数值有统计学差异(P<0.01)。治疗6个月后，两组TRAb-N基本都在正常范围，且无统计学差异。在整个治疗过程中，两组间TRAb-C比较均无统计学差异。因此应用ATDs治疗中，早期注意监测甲状腺功能，必要时应用小剂量LT4调节甲状腺功能，而对于整个ATDs治疗疗程，TRAb-N(TSAb)及TRAb-C(TSBAb)的变化影响不大。
因此，TSAb、TSBAb的检测对于确定TRAb的功能，对于确定甲减、甲亢的原因以及甲状腺功能波动的预测都是有意义的。而TSAb和TSBAb之间的转化发生在少数患者中，比如部分T4治疗的甲减患者或ATDs治疗的甲亢患者。这些变化的发生可能是因为个别患者相关的TSAb和TSBAb浓度、亲和力以及效力的不同[9]。ATDs治疗中暂时的早期的小剂量应用LT4未明显影响TSAb和TSBAb。
观察抗甲状腺药物(ATDs)治疗Graves病过程中，甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibody, TSAb)及甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulating blocking antibody, TSBAb)的变化，以及联合左甲状腺素(LT4)对TSAb及TSBAb的影响。
运用纯化的重组Trxfus.TSHRn、Trxfus.TSHRc蛋白为抗原，使用ELISA技术检测患者血清甲状腺受体抗体(TRAb)-N(以TSAb为主)、TRAb-C(以TSBAb为主)水平。回顾分析117例TRAb-N(＋)的Graves甲状腺功能亢进症(甲亢)患者ATDs治疗36个月中TRAb-N和TRAb-C的变化。ATDs治疗过程中，根据是否联合LT4分为两组，观察TRAb-N、TRAb-C的变化。
(1)117例TRAb-N(＋)Graves甲亢患者TRAb-N变化趋势不同。Ⅰ 组：10例患者持续TRAb-N(＋)且TRAb-C(－)，甲亢缓解率0%。Ⅱ组：17例患者TRAb-N变化复杂、反复波动，甲亢12例复发、5例缓解，甲亢缓解率29.4%。Ⅲ组：89例患者TRAb-N逐渐转阴，甲状腺功能15例复发、74例缓解，甲亢缓解率83.1%。卡方检验3组间有统计学差异(P<0.01)。(2)ATDs治疗中，根据是否联合LT4分为2组，A组联合治疗组(41例)；B组：单一ATDs治疗组(76例)。基线、3个月时，TRAb-N在A组与B组两组间比较均有统计学差异(P<0.01)。其他各组之间没有统计学差异。治疗30个月，TRAb-C在A组与B组两组间比较均没有统计学差异(P>0.05)。
TSAb、TSBAb的检测对于确定TRAb的功能，预测甲状腺功能变化是有意义的。ATDs治疗Graves病程中，暂时、早期小剂量应用LT4未明显影响TSAb和TSBAb。